L'effetto del micofenolato mofetile sui podociti nella nefrite sierica nefrotossica

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 14167 (2023) Citare questo articolo

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Il micofenolato mofetile (MMF) trova applicazione nelle malattie renali proteinuriche, ma l'esatto meccanismo del suo effetto sui podociti è ancora sconosciuto. I nostri precedenti esperimenti in vitro hanno suggerito che l'MMF può migliorare il danno dei podociti attraverso il ripristino dell'asse del citoscheletro Ca2+-actina. L'obiettivo di questo studio era di caratterizzare la biologia dei podociti durante il trattamento con MMF nella nefrite da siero nefrotossico (NTS). NTN è stato indotto in topi wild-type di tre settimane. Il giorno 3, metà dei topi è stata trattata con MMF (100 mg/kg peso corporeo/giorno PO) per una settimana. Il giorno 10, abbiamo eseguito l'analisi proteomica dei glomeruli e l'imaging a super risoluzione del diaframma a fessura. Per l'imaging multifotone della concentrazione di Ca2+ ([Ca2+]i), il disegno sperimentale è stato ripetuto nei topi che esprimevano il sensore Ca2+ specifico dei podociti. L'MMF ha migliorato la proteinuria e la formazione di mezzaluna indotte da NTS. Abbiamo identificato cambiamenti significativi nell'abbondanza di proteine coinvolte nella segnalazione del Ca2+ e nella regolazione del citoscheletro di actina, che è stato ulteriormente confermato dall'imaging diretto di [Ca2+]i nei podociti che mostravano livelli diminuiti di Ca2+ dopo il trattamento con MMF. Ciò è stato associato ad una tendenza al ripristino della struttura del processo del piede dei podociti. Qui, forniamo la prova che l’MPA ha un sostanziale effetto diretto sui podociti. L'MMF contribuisce al miglioramento di [Ca2+]i e al miglioramento del citoscheletro di actina disorganizzata nei podociti. Questi dati estendono la conoscenza degli effetti diretti degli immunosoppressori sui podociti che potrebbero contribuire ad un trattamento più efficace delle glomerulopatie proteinuriche con il minor numero possibile di effetti collaterali.

Le glomerulopatie rappresentano il 5-14% dei bambini con malattia renale cronica e il 15-29% dei bambini con insufficienza renale in tutto il mondo1. Molti pazienti affetti da glomerulopatie possono essere mantenuti in remissione solo mediante un trattamento a lungo termine con steroidi. Tuttavia, l’uso di questo farmaco per un periodo prolungato provoca gravi effetti avversi. Pertanto, soprattutto i pediatri hanno studiato opzioni terapeutiche alternative che risparmiano gli steroidi come il micofenolato mofetile (MMF) in questa popolazione vulnerabile2.

L'MMF, il profarmaco dell'acido micofenolico (MPA) biologicamente attivo, agisce come un potente inibitore reversibile dell'IMPDH, l'enzima chiave nella biosintesi de novo delle purine nei linfociti proliferanti, sopprimendo così le risposte immunitarie cellulo-mediate e la formazione di anticorpi3. Il primo studio sugli effetti renali dell'MMF ha dimostrato che previene il processo di rigetto cronico dell'allotrapianto diminuendo l'espressione delle molecole di adesione e delle citochine nei glomeruli, prevenendo così la glomerulosclerosi4. Negli ultimi due decenni, l’MMF si è affermato e ampiamente utilizzato anche nelle glomerulopatie infiammatorie5.

Al di là dell'effetto immunosoppressivo ben caratterizzato, sappiamo poco su come l'MMF agisca direttamente sul tessuto renale, in particolare sui podociti6,7. Nella nefropatia diabetica, nel gruppo trattato con MMF sono stati osservati un tasso apoptotico inferiore dei podociti e un'espressione preservata di nefrina e podocina8. Ciò è in accordo con i risultati di un modello con puromicina in cui l'inibizione dell'IMPDH ha ripristinato il pool di ATP, che ha mantenuto l'espressione di nefrina e sinaptopodina e ha stabilizzato il citoscheletro di actina9. Inoltre, Fu et al. hanno mostrato un effetto diretto dell'MMF in una malattia renale immunomediata: i topi MRL/lpr sono stati trattati con MMF. Successivamente, il sequenziamento dell'RNA eseguito sulla corteccia renale isolata ha mostrato una significativa diminuzione dell'espressione del gene Rac1, che interrompe la formazione fisiologica delle fibre di stress, quando attivato10. In linea con ciò, i nostri precedenti esperimenti in vitro che hanno eseguito il sequenziamento dell’RNA di una linea cellulare di podociti trattata con MPA hanno rivelato un accumulo dei termini “citoscheletro di actina” e “regolazione della trasduzione del segnale mediata da piccole GTPasi”. Inoltre, anche i termini “attività dei canali del calcio” e “trasporto degli ioni calcio” sono stati arricchiti11. L'aumento della concentrazione di calcio intracellulare ([Ca2+]i) nei podociti12 può portare ad una riorganizzazione acuta del citoscheletro di actina o addirittura al collasso citoscheletrico e alla proteinuria13,14,15,16. Nel presente studio, abbiamo voluto confermare se l'MMF è anche in grado di migliorare il danno dei podociti attraverso il ripristino dell'asse citoscheletrico Ca2+-actina in un modello in vivo di nefrite sierica nefrotossica (NTN).

10 years) in our vivarium. All animal experiments were performed in accordance with relevant guidelines and regulations provided by the LANUV NRW (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen/State Agency for Nature, Environment and Consumer Protection North Rhine-Westphalia). The experimental protocol was examined and approved by the LANUV NRW (VSG81-02.04.2020.A052), which adhered to the 3R principles. Each mouse was considered as n = 1. Altogether 13 mice (5 females, 8 males) constituted the control group, 11 mice (7 females, 4 males) the NTS + veh group and 12 mice (7 females, 5 males) the NTS + MMF group. NTN was induced in three-week old mice (nephrogenesis is already completed, but they are not yet sexually mature) as follows: The animals received intraperitoneal injection of nephrotoxic serum (NTS; Probetex, San Antonio, USA) in a dose of 10 µl/g body weight (BW) on two consecutive days. From a pathogenic point of view, the historically coined term “nephrotoxic” is misleading since the serum induces an immune-mediated process. In detail, nephrotoxic antibodies (heterologous sheep antibodies raised against rat whole glomeruli) are deposited in the whole glomerulus including the subepithelial, subendothelial areas as well as mesangium. Subsequently, mesangial proliferation and crescent formation can be observed. Thus NTN serves as a model for immune-mediated glomerulopathy with proteinuria (Fig. 1a). In our study, all NTS-injected mice showed proteinuria on day 3. Mice without NTS induction served as control. Confounders were not controlled. On day 3, either water (NTS + veh) or MMF (Roche, Mannheim, Germany) in a dose of 100 mg/kgBW/d (NTS + MMF) were administered per oral gavage for seven days. They were then anesthetized with ketamine and xylazine followed by cardiac blood sampling and sacrificed by cardiac perfusion with cold phosphate-buffered saline (PBS). Depending on the further examination technique, mice were additionally perfused with 4% paraformaldehyde. The kidneys were removed and either put in melted agarose for acute kidney slices (AKS) or in 4% neutral buffered formalin for stimulated emission depletion (STED) imaging. Spot urine samples were taken before injection with NTS, on day 3 and the last day. The experimental design is depicted in Fig. 1b./p> 1.5) when comparing NTS + MMF with NTS groups. To clarify molecular functions and biological processes affected by MMF-regulated proteins, we performed Gene Ontology (GO) analyses. Figure 3 depicts a selection of significant GO terms. From the enrichment analysis, we could outline two major groups of terms that were of particular interest: Ca2+ signaling and regulation of actin cytoskeleton (Fig. 3a, b). Of the numerous identified proteins with a p value < 0.05 (Supp. Table 3), we analyzed the ones related to Ca2+ signaling and/or actin cytoskeleton regulation displayed as a heat map (Fig. 4a, b). Additionally, the distribution of the most relevant proteins for Ca2+ signaling and actin cytoskeleton regulation are shown in volcano plot (Fig. 4c). For Ca2+signaling, two proteins attracted our interest (Supp. Table 3). Wbp2, which leads to Ca2+ influx from the ER into the cytoplasm. In addition, Stim2, which is responsible for the Ca2+ influx from the extracellular into the intracellular fluid. Both were significantly down-regulated in NTS + MMF mice compared to NTS + veh group. In line with that, we detected significant changes in the expression of Ca2+-dependent proteins such as Cpne1, Cpne4, Cpne8, Fbln1, Fbln2 and Rasgrp2 (Supp. Table 3). Another group of altered proteins was involved in the regulation of the actin cytoskeleton. The protein expression level of several positive regulators for the Rac1 such as Micall2, Dock7, Trio and Fgd5 were highly down-regulated in NTS + MMF vs. NTS + veh group (Supp. Table 3). The significant reduction in the expression level of the down-stream protein Wasf2 also points in this direction (Supp. Table 3). Additionally, we found the expression level of Arhgap29, a positive regulator for RhoA, highly up-regulated (Supp. Table 3). It was in line with the increased protein level of Spn and Eif5a, which are known to promote stress fiber formation (Supp. Table 3). Finally, we observed a decreased expression level of the lamellipodia inducing Shank3 (Supp. Table 3)./p>|0.58|) altered proteins from the glomeruli proteome analysed using the ShinyGo Gene Ontology (GO) Enrichment Analysis. Panel (a) shows the comparison between NTS and control mice (NTS effect). Panel (b) shows the comparison between NTS + MMF and NTS + veh mice (therapy effect). On the left: the lollipop graphic of altered GO Molecular Functions; on the right: network analysis of the altered GO Molecular Functions. Controls n = 4; NTS + veh n = 4; NTS + MMF n = 6; NTS: nephrotoxic serum; MMF: mycophenolate mofetil./p>

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